人抗硬皮病抗体 70 (anti-SCL70)酶联免疫分析
预期应用 ELISA 法定量测定人血清,血浆,细胞培养上清或其它相关生物液体中 anti-SCL70 含量. 实验原理 用纯化的抗原包被微孔板,制成固相载体,往包被 SCL70 的微孔中依次加入标本或标准品, 生物素化的 SCL70,HRP 标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色.TMB 在过氧 化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的 anti-SCL70 呈正相关.用酶标仪在 450nm 波长下测定吸光度(OD 值),计算样品浓度. 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板:一块(96 孔) 2. 标准品(冻干品): 2 瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml,盖好后静置 10 分钟以 上,然后反复颠倒/搓动以助溶解,其浓度为 100 U/L,做系列倍比稀释(注:不要直接在板 中进行倍比稀释) 分别稀释成 100 U/L,50 U/L,25 U/L,12.5 U/L,6.25 U/L,3.12 U/L,1.56 后, U/L,样品稀释液直接作为标准浓度 0 U/L,临用前 15 分钟内配制. 如配制 50 U/L 标准品:取 0.5ml (不要少于 0.5ml ) 100 U/L 的上述标准品加入含有 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中,混匀即可,其余浓度以此类推. 3. 样品稀释液:1×20ml/瓶. 4. 检测稀释液 A:1×10ml/瓶. 5. 检测稀释液 B:1×10ml/瓶. 6. 检测溶液 A:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液 A 1:100 稀释,稀释前根据预先计 算好的每次实验所需的总量配制(100ul/孔),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml.如 10ul 检测 溶液 A 加 990ul 检测稀释液 A 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制.局限性硬皮病系统性硬皮病的症状和治疗
7. 检测溶液 B:1×120ul/瓶(1:100)临用前以检测稀释液 B 1:100 稀释.稀释方法同检测溶 液 A. 8. 底物溶液:1×10ml/瓶. 9. 浓洗涤液:1×30ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍. 10. 终止液:1×10ml/瓶(2N H2SO4). 标本的采集及保存 1. 血清:全血标本请于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 1000 x g 离心 20 分钟,取上清即可 检测,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融. 2. 血浆:可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂,标本采集后 30 分钟内于 2 - 8° C 1000 x g 离心 15 分钟,或将标本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融. 3. 细胞培养物上清或其它生物标本:请 1000 x g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本 放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融. 注: 以上标本置 4℃保存应小于 1 周 ,-20℃或-80℃均应密封保存, -20℃不应超过 1 个 月 , -80 ℃不应超过 2 个月;标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测;高血 脂的标本不需进行特殊处理,可直接检测.
操作步骤 实验开始前,请提前配制好所有试剂;试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡 . 每次检测都应该做标准曲线.如样品浓度过高时,均应用样品稀释液进行稀释,以使样品符 合试剂盒的检测范围.建议各实验室在操作前先进行预实验以建立最佳稀释倍数. 1. 加样:分别设空白孔,标准孔,待测样品孔.空白孔加样品稀释液 100ul,余孔分别加标 准品或待测样品 100ul,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁, 轻轻晃动混匀,酶标板加上盖或覆膜,37℃反应 120 分钟. 为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液. 2. 弃去液体,甩干,不用洗涤.每孔加检测溶液 A 工作液 100ul(在使用前一小时内配制) ,